生成的红色偶氮化合物在nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以Nμg/（g·h）为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。

Ⅰ.离体法

一、材料、仪器设备及试剂

（一）材料

水稻、小麦叶片、幼穗等。

（二）仪器设备

冷冻离心机，分光光度计，天平（感量0.1mg），冰箱，恒温水浴，研钵，剪刀，离心管，具塞试管，移液管，洗耳球。

（三）试剂

（1）亚硝酸钠标准溶液。准确称取分析纯NaNO20.g溶于无离子水后定容至mL，然后再吸取5mL定容至mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。

（2）0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液。Na2HPO4·12H.g与NaH2PO4·2H2O2.g加无离子水溶解后定容至mL。

（3）1%磺胺溶液。1.0g磺胺溶于mL3mol/LHCl中（25mL浓盐酸加水定容至mL即为3mol/LHCl）。

（4）0.02%萘基乙烯胺溶液。0.g萘基乙烯胺溶于mL无离子水中，贮于棕色瓶中。

（5）0.1mol/LKNO3，溶液。2.gKNO3，溶于mL0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液。

（6）0.mol/LpH8.7的磷酸缓冲液。8.gNa2HPO4·12H2O.gK2HPO4·3H2O溶于mL无离子水中。

（7）提取缓冲液。0.12ltg半胱氨酸、0.gEDTA溶于mL0.mol/LpH8.7的磷酸缓冲液中。

（8）2mg/mL.NADH溶液。2mgNADH溶于1mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液中（临用前配制）。

二、实验步骤

（一）标准曲线制作

取7支洁净烘干的15mL刻度试管按表2-9-1顺序加入试剂，配成0~2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然后在nm下比色测定。以亚硝态氮（μg）为横坐标（x），吸光度值为纵坐标（y）建立回归方程。

（二）样品中硝酸还原酶活力测定

1.酶的提取

称取0.5g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4mL提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在4℃、r/min下离心15min，上清液即为粗酶提取液。

2.酶的反应

取粗酶液0，4mL于10mL试管中，加入1，2mL0.1mol/LKNO3磷酸缓冲液和0.4mLNADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液、而以0.4mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液代替。

3.终止反应和比色测定

保温结束后立即加入1mL磺胺溶液终止酶反应，再加1mL萘基乙烯胺溶液，显色15min后于r/min下离心5min，取上清液在nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量（μg）。

三、结果计算

Ⅱ、活体法

一、材料、仪器设备及试剂

（一）材料

水稻、小麦叶片、幼穗等。

（二）仪器设备

真空泵、真空干燥器，小烧杯，玻璃瓶塞，其他用具同离体法。

（三）试剂

（1）亚硝酸钠标准液（同离体法）。

（2）0.1mol/LKNO3。

（3）1%磺胺。

（4）0.02%茶基乙烯胺（配制方法同离体法）。

（5）30%三氯乙酸溶液。30g三氯乙酸，水溶后定容至mL。

二、实验步骤

（一）标准曲线制作同离体法。

（二）酶反应及活性测定

1.取样

称取作物叶片1.0~2.0g四份，剪成1cm左右的小段，放于小烧杯中，用直径略小于烧杯直径的玻璃瓶塞将材料全部压于杯底，其中一份作对照，另外三份作酶活性测定用。

2.反应

先向对照管中加入1mL30%三氯乙酸，然后各管中都加入9mL0.1mol/LKNO3、溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气1min再通入空气，再抽真空，反复几次，以排除组织间隙的气体，至叶片完全软化沉入杯底，以便底物溶液进入组织。最后通入氮气密封后，在25℃黑暗中反应0.5h，再分别向测定管（对照管除外）加入1mL30%三氯乙酸终止酶反应。

3.比色测定

将各管摇匀静置2min后，各取2mL反应液，加入1mL磺胺和1mL萘基乙烯胺，摇匀显色15min后，于r/min下离心5min，取上清液于nm处测其吸光度。根据标准曲线计算出反应液中生成的亚硝态氮总量（p.g）。

二、结果计算：同离体法

（1）硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4℃下进行。

（2）取样宜在晴天进行，最好提前一天施用一定量的确态氮肥，取样部位应一致。

（3）硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防亚硝酸盐还原为氨。

（4）从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。