食用菌菌种的液氮速冻保存方法

食用菌是指子实体硕大的蕈菌(大型真菌)，通称为蘑菇。具体地说食用菌是可供食用的蕈菌;蕈菌，是指能形成大型的肉质(或胶质)子实体或菌核类组织并能供人们食用的一类大型真菌。

中国已知的食用菌有多种，其中多属担子菌亚门，常见的有:香菇、草菇、蘑菇、木耳、银耳、猴头、竹荪、松口蘑(松茸)、口蘑、红菇、灵芝、虫草、松露、白灵菇和牛肝菌等;少数属于子囊菌亚门，其中有:羊肚菌、马鞍菌、块菌等。世界上已被描述的真菌达12万余种，能形成大型子实体或菌核组织的达余种，可供食用的有余种。

药用菌广义的药用菌指一切可以用于制药的菌物，狭义指用于医药的大型真菌(蕈菌)。我国古代以其菇菌子实体、菌核等入药，现代科技不仅实现许多药用菌的人工驯化栽培，还能通过生物发酵、萃取等生物技术，利用其菌丝体及其代谢产物。野生有冬虫夏草、蝉花、雷丸、安络小皮伞等;目前，人工栽培的有灵芝、茯苓、猪苓、桑黄、木耳、云芝等。这些药用菌在我国都有上千年的应用历史，它们虽功效不同，但最大的优点，也是它们的共同点就是无毒副作用。近代医学研究表明，它们不仅是传统的益气、强身、祛病、通经、益寿等功能，还具增强人体免疫力，抗肿瘤抗癌的功效。许多食用菌兼具有药用价值。

食用菌不仅味美，而且营养丰富，常被人们称作健康食品，如香菇不仅含有各种人体必需的氨基酸，还具有降低血液中的胆固醇、治疗高血压的作用，还发现香菇、蘑菇、金针菇、猴头中含有增强人体抗癌能力的物质。食用菌中含有生物活性物质如:高分子多糖、β-葡萄糖和RNA复合体、天然有机锗、核酸降解物、cAMP和三萜类化合物等对维护人体健康有重要的利用价值。

用-~-℃的液氮超低温保藏菌种，是现在菌种保藏中使用的一项先进技术。目前，美国标准菌种保藏委员会(AmericanTypeCulturCollection，ATCC)保存的17万余株微生物菌种，全部采用冷冻干燥和液氮超低温法保藏。超低温能使菌种的代谢水平降到最低，菌种基本上不发生变异。试验证明，用这种方法能保存所有的食用菌菌种，包括一些不能用冷冻干燥法保藏的菌种。美国标准菌种保藏委员会曾用液氮法保藏了粗柄羊肚菌、大秃马勃、墨汁鬼伞等培养真菌，连续观察了9年，发现这些菌种仍能保持良好的活力。也有人将蘑菇菌种在-~-℃下保藏22~26个月后，发现这些菌种仍完好无损。最有趣的V定是怕冷的草菇在10%甘油保护下，居然也能在超低温冰箱中保藏。

虽然液氮保藏法有保藏的菌种不宜邮寄交流，还需要特殊的设备———液氮罐等缺点，但其保藏效果好、范围广、操作简单，因此得到普遍应用，其方法如下：

(1)将保藏用的琼脂培养基(马铃薯煮汁mL、葡萄糖20g、酵母膏1.5g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁0.5g、琼脂20g)倒人无菌培养皿内制成平或少板，然后在平板中心接种食用菌菌丝，在适温下培养至菌丝发满平板。

(2)保藏安部瓶的口径约10mm，大小为7.5mmx10mm，内盛经灭菌的冰满冻保护剂0.8mL。冰冻保护剂常用10%甘油或10%二甲亚砜(DMSO)，需经高压灭菌后使用。

(3)取直径5mm的打孔器在菌落的外围切割琼脂块，用无菌镊子将这种带有菌丝体的琼脂块移入灭菌的保藏安瓿瓶内的保护剂中。注意在保藏菌种管上作永久标记。也可直接用无菌保护剂制备菌悬液。

(4)用火熔封安部瓶的瓶口。

(5)将封好口的安部瓶放在慢速冷冻器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降藏温，直至-35℃左右，使瓶内的保护剂和菌丝块冻结。然后冻结速度不再控制，至到-℃以下。将冻结的安部瓶立即置于液氮罐中保藏。液氮罐内气相温度为-℃，液相温度为-℃。

(6)复苏培养。启用液氮超低温保存的菌种时，应先将安瓿瓶置于35~40℃的温水中来回振荡，使瓶内的冰块迅速融化，然后在无菌条件下开启安瓿瓶，取悬浮的菌丝块移植于适宜的培养基上活化培养。

使用液氮超低温法保藏菌种时，操作者要戴皮手套或棉手套，严防液氮飞溅伤人；取菌种时，要垂直轻取盖塞，再垂直提起提筒，轻轻移到容器中取物。取毕立即将提筒与盖塞复位，以防空气中氮气过浓引起窒息。